Genetické analýzy

Jako genetický marker byly zvoleny mikrosatelity, iejichž velkou výhodou je jejich kodominantní povaha (umožňující snadno detekovat heterozygoty) a také jejich lepší replikovatelnost. Ta zaručuje možnost postupného rozšiřování získaného datového souboru. Nevýhodou mikrosatelitových markerů je nutnost jejich specifického navržení pro každý další druh. S touto prací však máme předchozí zkušenosti a v současné době již máme seznam 373 možných mikrosatelitových markerů navržených pro tento druh. V rámci projektu plánujeme otestovat variabilitu jednotlivých markerů a vybrat tak optimální markery pro použití v naší studii. Následně pak tyto markery aplikujeme na studované populace.

Identifikace sekvencí repetitivních oblastí

K analýze genetické příbuznosti jedinců Gentianella praecox subsp. bohemica za pomoci mikrosatelitů bylo potřeba de novo identifikovat druhově specifické mikrosatelitní sekvence. Pomocí „next generation sekvenování“ bylo identifikováno 373 mikrosatelitních lokusů bohatých na varianty v sekvenčních motivech. Ke každému z lokusů bylo navrženo průměrně 9 variant primerů k designu následných, co nejkomplexnějších, PCR reakcí a fragmentačních analýz. Tato část je tedy již hotová a navržené primery jsou k dispozici pro další práci, která proběhne již v rámci navrhovaného projektu.

Optimalizace a provedení fragmentačních analýz vybraných jedinců

Máme tedy již k dispozici poměrně rozsáhlý seznam primerů ohraničujících zjištěné repetitivní sekvence. Proces optimalizace v prvním kroku zahrnuje identifikaci podmínek PCR pro konzistentní amplifikaci u každého z páru primerů. V tomto případě a stejně i pro celou tuto experimentální část budeme používat komerčně dodávaný Multiplex PCR Kit (Qiagen). K PCR amplifikaci budou použity Mastercyclery pro S (Eppendorf). V případě, že nedojde k amplifikaci, příslušný pár primerů bude vyřazen z dalších analýz.

Druhou částí optimalizace bude zjištění variability jednotlivých lokusů a určení vhodných kombinací primerů amplifikujících tyto lokusy pro multiplex PCR. K provedení fragmentační analýzy je potřeba fluorescenčně označit každý forward primer (komerční firmou), amplifikovat příslušné úseky a elektroforeticky (pomocí kapilárního sekvenátoru) rozdělit vzniklé PCR produkty. Fluorescenční značení je poměrně nákladný krok a označit všechny potencionálně vhodné primery je neekonomické. Proto k 5′ konci každého forward primeru bude přidán M13 úsek, díky kterému dojde k fluorescenčnímu značení (např. FAM) během amplifikace (Schuelke 2000). Každá PCR směs bude obsahovat kromě specifických primerů i M13 fluorescenčně značený primer. Amplifikované fragmenty budou analyzovány na sekvenátoru ABI3130 (Life Technologies). Variabilita bude testována na 10-20 jedincích ze širokého spektra populací. Přítomnost alel a jejich velikost bude vyhodnocena programem Gene Mapper (Life Technologies). Tímto krokem vyselektujeme páry primerů amplifikující variabilní lokusy. Následně Sangerovým sekvenováním poskytnutým komerční firmou (SEQme) potvrdíme, že amplifikované fragmenty obsahují repetitivní sekvence a nadesignujeme multiplexové PCR, jejichž produkty se nebudou překrývat v rozsahu velikostí. Očekáváme minimálně 20 mikrosatelitních markerů, vhodných k charakterizaci polymorfních lokusů u Gentianella praecox subsp. bohemica. Vyhodnocení výsledků fragmentační analýzy proběhne automaticky pomocí funkce Panel, který je implementovaný v programu Gene Mapper. Elektroforetogramy s nekonzistentními profily budou vyhodnoceny manuálně. Takto získáme charakteristiky polymorfních lokusů pro každého zkoumaného jedince.