Genetické analýzy a jejich zpracování

Ke studiu genetické diversity druhu byla použita analýza mikrosatelitů. První část listových vzorků (sebraných na podzim 2014) posloužila jako materiál pro optimalizaci protokolů k izolaci DNA, optimalizaci PCR reakcí a k optimalizacím multiplex PCR (MM PCR) reakcí. Následně bylo provedeno testování a výběr vhodných lokusů, přičemž finální počet lokusů je 12, rozdělených do 3 MM PCR reakcí. Protokoly optimalizovaných MM PCR reakcí pro nejvhodnější vybrané lokusy byly připraveny, úspěšně testovány a použity pro genotypování všech jedinců.

Následně byly postupně zpracovávány všechny sebrané vzorky hořečku českého a blízce příbuzných druhů hořečku nahořklého pravého a hořečku drsného Sturmova. Zpracováno tak bylo téměř 1400 jedinců. Nejprve bylo provedeno klonování vybraných lokusů, čímž byly potvrzeny sekvence vybraných úseků a specificita použitých oligonukleotidů. Následně jsme přistoupili k izolacím DNA a genotypování studovaných jedinců.

Obsluha Termocycleru – multipexová PCR

Obsluha sekvenátoru – fragmentační analýzy vzorků

Získané elektroforetogramy byly vyhodnoceny pomocí programů GeneMapper a GeneMarker a validovány. Ze získaných genetických dat jsme pro každou populaci vyjádřili počet alel, očekávanou heterozygositu (He) a mírů inbreedingu (Fis). Následně byla data statisticky zpracována a vyhodnocena.

Předběžná analýza mikrosatelitů v programu GeneMarker

Předběžná analýza mikrosatelitů v programu GeneMarker